外泌體為細胞分泌而來的微小囊泡，直徑在30-150nm之間，是細胞旁分泌的重要組成部分 [1-2]。它們參與細胞因子、mRNA、miRNA和蛋白質等生化物質的運輸，因此在細胞間通訊中起著至關重要的作用[3]。
氧濃度已被公認為在MSCs的增殖、分化和自我更新過程中至關重要[4]。然而，在體外培養條件下，MSCs通常處于常氧狀態，這與自然生理條件下體內的氧氣濃度非常不同。事實上，很大一部分MSCs存在于體內缺氧的環境中[5]。有研究表明，在梗死心臟模型的研究中發現，缺氧處理后來源于MSCs的外泌體表現出血管化增加、心肌細胞凋亡率降低和心臟祖細胞募集增加[6]。同時，還有一項研究證明，當 MSCs 在 3D 細胞培養中呈球狀培養時，與在 2D 細胞培養中分泌的外泌體相比，外泌體的產生顯著增加。此時球體的中心區域是缺乏氧氣和營養的，也正是因為球體內部區域的細胞團積累引起的輕度缺氧，從而增加了 MSCs 的存活率和這些細胞的分泌能力[7]。這些研究均證明了，MSCs的缺氧處理可以顯著增強其生物學功能和活性，從而提高MSCs分泌外泌體的能力。
圖1. 缺氧MSCs衍生外泌體對心肌梗死后心臟修復的作用和機制的示意圖[6]。
本次實驗通過研究人臍帶來源MSCs在CEL-G® Culture Ad60固定床生物反應器（Ad60 FBR）FB-2 中的生長情況，使用相同來源的MSCs、相同培養基、相同細胞接種密度（2E4 cells/cm2），分別設置高溶氧（DO=80±10%）和低溶氧（DO=40±10%）進行培養，摸索出MSCs 在低溶氧狀態下的 3D 培養工藝。相較于高溶氧狀態下，低溶氧罐成功培養了25天，并收獲了多達 12 批次的細胞上清液，為外泌體生產提供了更高效的技術支持。
Ad60 FBR，可提供細胞生長面積2 m2，工作體量相當于40層細胞工廠，工作體積850 mL；
人臍帶來源MSCs，準備的種子細胞總量：4×108 cells/batch，即細胞接種密度為2×104 cells/cm2；
CEL-G® Culture MSC Basal SFM 完全培養基（擴增用）；CEL-G® Culture MSC ExoPro SFM 完全培養基（生產用）；
高溶氧DO=80±10%；低溶氧DO=40±10%；
高溶氧15 days；低溶氧 25 days。
Day-1進行電極校準，固定床罐體及物料瓶進行121℃ 30min高溫滅菌，冷卻后加入800mL培養基，參數設置：pH7.10，溫度37.0℃，轉速620rpm，其中高溶氧罐DO設置80%，低溶氧罐DO設置40%；
Day0制備50mL細胞懸液進行細胞接種，接種6小時取樣鏡檢無大量游離細胞后開啟外循環，外循環培養基體積700mL，循環流速10mL/min，轉速500rpm；
進入細胞擴增階段，每天取上清進行生化指標監測；
Day3起每隔48h收獲罐內外上清并更換1L新鮮培養基進行循環；
將收獲的細胞上清原液進行NTA檢測，并進行溶氧狀態對外泌體表達情況的比較。
在細胞接種后每天取樣進行葡萄糖、乳酸及LDH的相關代謝濃度統計。統計結果顯示，低溶氧罐（L-DO組）較高溶氧罐（H-DO組）中細胞代謝更為活躍，證明細胞生長狀態良好。具體生化代謝濃度統計數據對比如下：
圖2. MSCs在Ad60 FBR 上高溶氧（H-DO）及低溶氧（L-DO）條件下生化代謝濃度對比曲線：(A)葡萄糖代謝趨勢; (B)乳酸代謝趨勢; (C)LDH 代謝趨勢。
收獲階段，分別從Day3起每隔48h進行細胞上清原液的全收獲。低溶氧罐的培養周期從15days延長至 25days，收獲批次從高溶氧罐收獲7批次上清液延長至收獲12批次上清液，且各批次外泌體產量均能穩定達到1×1014 particles 以上。具體各批次收獲的外泌體檢測數據對比如下：
圖3. MSCs在Ad60 FBR上高溶氧（H-DO）及低溶氧（L-DO）條件下外泌體收獲檢測數據：(A)多批次收獲外泌體總產量; (B)多批次收獲外泌體累計總產量。
經評估，Ad60 FBR 2m2 高溶氧罐最終培養15days，收獲外泌體總體積7.5L，得到外泌體總產量為1.12E15 particles。低溶氧罐最終培養25days，收獲外泌體總體積12.5L，得到外泌體總產量為2.18E15 particles。此次研究證明了，低溶氧條件可顯著提高細胞代謝水平，延長培養時間、增加外泌體收獲批次，從而提高總產量。此次實驗的外泌體產量也得到了喜人的結果，為后續MSC進行更大規模的培養及外泌體收獲提供了數據支撐。
CEL-G® Culture Ad60系列
固定床生物反應器（Ad60 FBR）介紹
Ad60 FBR由同騰新創（蘇州）科技有限公司自研，反應器由一個不銹鋼罐體培養容器與控制主機構成，培養罐體內采用PET膜材為細胞生長提供3D微環境，具有獨特的瀑布流設計，讓固定床具備更小的剪切力，提供更加親和的細胞培養環境，控制主機體型較小可以放入生物安全柜進行無菌合規操作。Ad60 FBR能夠提供從1m2至60m2的細胞培養面積，可實現從工藝參數的開發到中試驗證再到GMP生產的線性放大，可應用于細胞和基因治療、溶瘤病毒、干細胞/外泌體生產和疫苗等領域。
圖4. CEL-G® Culture Ad60 系列固定床生物反應器
CEL-G® Culture MSC 無血清培養基介紹
同騰新創自主研發的CEL-G® Culture MSC 培養基系列，目前主要有以下兩款產品。一款是CEL-G® Culture MSC Basal SFM間充質干細胞無血清基礎培養基，適用于多種來源的間充質干細胞原代分離培養、以及傳代擴增培養；Basal培養基支持MSC穩定傳代至15代。另一款是CEL-G® Culture MSC ExoPro SFM間充質干細胞外泌體生產無血清培養基，適用于間充質干細胞外泌體生產的細胞擴增階段、以及收獲階段；ExoPro培養基支持MSC 2D、3D細胞培養收獲外泌體。CEL-G® Culture MSC 無血清培養基為MSC的培養及干細胞制劑的研發提供了科學的保障。
圖5. CEL-G® Culture MSC 無血清培養基
