本文接下來將介紹AD60 FBR在慢病毒生產(chǎn)過程又一典型的應用案例，該研究對慢病毒生產(chǎn)過程中質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件和細胞培養(yǎng)參數(shù)進行了工藝測試及優(yōu)化，并使用優(yōu)化后的工藝條件在表面積為2m²的AD60 FBR驗證測試收獲了高達2.4×10¹⁰ TU產(chǎn)量的慢病毒。研究結(jié)果為建立基于AD60 FBR的慢病毒載體高效生產(chǎn)工藝提供了強有力的數(shù)據(jù)支撐。

該研究結(jié)果來自于華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，研究過程中使用的PET膜材及AD60 FBR系上海同騰生物科技有限公司自主研發(fā)。文末可查看原文，以下為主要研究結(jié)果。

基因治療能將外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到患者細胞中，通過抑制或增強基因表達、修正靶基因，從而實現(xiàn)疾病的治療。而在諸多外源基因的轉(zhuǎn)移方法中，慢病毒載體具有巨大的應用潛力。慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科中的復雜逆轉(zhuǎn)錄病毒，大多由人類免疫缺陷病毒-1 (Human Immunodeficiency Virus Type 1, HIV-1) 改造而來，能夠同時轉(zhuǎn)導分裂及非分裂期細胞，具有將外源基因穩(wěn)定整合至宿主細胞基因組的能力。目前慢病毒載體的應用市場廣闊且前景可觀，預計2026年慢病毒市場將增長至8億美元。

慢病毒的生產(chǎn)主要使用貼壁生長的HEK293T細胞，為實現(xiàn)慢病毒的生產(chǎn)，需要對HEK293T細胞進行規(guī)模化培養(yǎng)。目前較多使用的細胞工廠制備工藝路線生產(chǎn)LVs具有多重限制，其中包括且不限于收獲時間限定較緊、人工勞動強度大、系統(tǒng)操作多為開放式并且需要大量的培養(yǎng)箱空間，這些限制為后續(xù)商業(yè)化規(guī)模的病毒制備帶來了壓力，為了克服當前工藝的局限性，固定床生物反應器這種擴展性高的三維貼壁培養(yǎng)體系正在逐漸應用流行，其中商業(yè)化較為成熟的固定床反應器包括 Pall 公司的iCELLis 和 Univercells 公司的 Scale-X 以及國產(chǎn)品牌上海同騰生物的AD60 FBR。

AD60 FBR反應罐體內(nèi)填充有固定化細胞的固相載體PET膜材料（Fig.1），可以為細胞貼附生長提供適宜的介質(zhì)類型、氣體控制、溫度控制及pH控制等多重精細化支持。當細胞被攪拌驅(qū)動攔截在雙層螺旋纏繞的PET膜材空隙中時，培養(yǎng)液流經(jīng)后與細胞進行傳質(zhì)傳氧，這種培養(yǎng)方式極大的避免了攪拌引發(fā)的剪切力及碰撞造成的細胞損傷等。相對于細胞工廠而言，固定床反應器有著明顯的培養(yǎng)面積優(yōu)勢，AD60 FBR培養(yǎng)面積設計為1 m²/2 m²、20 m²以及60 m²，對應的細胞工廠層數(shù)（細胞工廠每層培養(yǎng)表面積0.063m²）分別是16/32層、320層以及950層，放大規(guī)模的AD600 FBR培養(yǎng)面積則高達300 m²/600 m²，對應的細胞工廠層數(shù)更是達到了4800層/9600層。另外細胞在AD60 FBR培養(yǎng)過程中的分布十分均勻，能對后續(xù)批次重復及放大提供穩(wěn)定性與重復性支持，從而能加快產(chǎn)品上市速度。

Figure 1 AD60 FBR反應器及載體膜材示意圖

在使用固定床反應器生產(chǎn)慢病毒的過程中，轉(zhuǎn)染條件(如轉(zhuǎn)染時DNA的濃度、轉(zhuǎn)染試劑與DNA的比例)以及細胞培養(yǎng)操作參數(shù) (如接種密度、轉(zhuǎn)染時的細胞密度等)均能夠影響慢病毒的生產(chǎn)。為了實現(xiàn)高效的慢病毒生產(chǎn)，需要探究轉(zhuǎn)染條件對轉(zhuǎn)染效率的影響和操作參數(shù)對慢病毒滴度的影響，據(jù)此設計并開發(fā)慢病毒生產(chǎn)工藝。

本研究首先考察了轉(zhuǎn)染試劑聚乙烯亞胺 (Polyethyleneimine, PEI)與DNA 的混合比例、混合時的 DNA濃度和混合時間、轉(zhuǎn)染時DNA的濃度和轉(zhuǎn)染時間對轉(zhuǎn)染效率及外源基因表達的影響。實驗轉(zhuǎn)染條件分別設置為：PEI與DNA的質(zhì)量比為0.5:1, 1:1, 2:1, 4:1,6:1，PEI與DNA混合時轉(zhuǎn)染復合物中DNA的濃度為5, 10, 20, 40, 60μg/mL，混合時間為 0, 5, 10, 20, 30, 60 min，轉(zhuǎn)染時的DNA濃度為1, 2, 3, 4 μ g/mL，轉(zhuǎn)染持續(xù)時間為2, 4, 6, 8, 10, 12 h。

當PEI與DNA質(zhì)量比為 2:1，轉(zhuǎn)染時DNA濃度為2 μ g/mL，轉(zhuǎn)染時間為6 h時，轉(zhuǎn)染效率即可達到最高，繼續(xù)增加此3個轉(zhuǎn)染條件的設置值，轉(zhuǎn)染效率不再提高（Fig.2，a、d、e）。而轉(zhuǎn)染復合物中 DNA 濃度和混合時間對轉(zhuǎn)染效率無顯著影響（Fig.2，b、c）。

Figure 2 轉(zhuǎn)染條件對轉(zhuǎn)染效率的影響：(a) PEI:DNA；(b) 轉(zhuǎn)染復合物中DNA濃度；(c) 混合時間；(d) 轉(zhuǎn)染時DNA濃度；(e) 轉(zhuǎn)染時間 (**: p<0.01; ***: p<0.001)

當PEI與DNA的比例為2:1時相對熒光強度最大，隨上述比例繼續(xù)增大，相對熒光強度出現(xiàn)了小幅下降（Fig.3, a）、轉(zhuǎn)染時的DNA濃度增大和轉(zhuǎn)染時間延長均有利于外源基因表達（Fig.3, d、e），但較高的DNA濃度將增加生產(chǎn)成本，且在無血清培養(yǎng)條件下長時間轉(zhuǎn)染可能導致細胞活性降低。因此選擇2μg/mL的DNA濃度和6 h 的轉(zhuǎn)染時間。轉(zhuǎn)染復合物中DNA濃度和混合時間對基因表達量的影響較小，二者分別為 20μg/mL 和10 min時基因表達量最高（Fig.3, b、c）。

Figure 3 轉(zhuǎn)染條件對基因表達的影響：(a) PEI:DNA；(b) 轉(zhuǎn)染復合物中DNA濃度；(c) 混合時間；(d) 轉(zhuǎn)染時DNA濃度；(e) 轉(zhuǎn)染時間 (*: p<0.05; **: p<0.01; ***: p<0.001)

基于優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染條件，在孔板和載有PET膜材的孔板（即孔板3D固定床模型）中進行慢病毒生產(chǎn)。在孔板中進行細胞培養(yǎng)時，生產(chǎn)的慢病毒滴度較高，可達2.9×10⁷ TU/mL，表明在優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件下可以生產(chǎn)高滴度的慢病毒。與孔板組相比，孔板3D固定床模型組的慢病毒滴度較低（Fig.4）。考慮到PET膜材具有較高的比表面積，與孔板相比可以支持更多的細胞貼附和生長，因此需優(yōu)化轉(zhuǎn)染時的細胞密度等參數(shù)，以提高收獲的慢病毒滴度。

Figure 4 孔板及孔板3D固定床模型生產(chǎn)的慢病毒滴度

隨后將PET膜材置于搖瓶中，采用動態(tài)培養(yǎng)模型模擬固定床反應器中的培養(yǎng)過程（即搖瓶3D固定床模型），探究接種密度對細胞生長的影響。將 HEK293T 細胞按 2.0×10³, 5.0×10³, 1.0×10⁴, 5.0×10⁴cells/cm²的密度分別接種至搖瓶中并進行培養(yǎng)。在5.0×10⁴cells/cm²的接種密度下，搖瓶中HEK293T細胞生長良好，細胞在第6天進入指數(shù)生長期，第12天時細胞密度最高，達到2.8×10⁶cells/cm²。此后細胞生長進入穩(wěn)定期（Fig.5）。

Figure 5 不同接種密度下的HEK293T細胞生長曲線

對不同接種密度下第6, 10和14天的細胞進行活死染色，活細胞被染成綠色，死細胞被染成紅色。在較高的接種密度 (1.0×10⁴和5.0×10⁴cells/cm²)下，HEK293T細胞在搖瓶3D固定床模型上的分布較為均勻。培養(yǎng)至第10天時，5.0×10⁴cells/cm²組的細胞已長滿整個膜材，活性良好。而接種密度降低，膜材上的細胞呈團簇聚集，不均勻的細胞分布和過低的細胞密度不利于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和病毒生產(chǎn)。因此后續(xù)實驗將采用5.0×10⁴cells/cm²的接種密度（Fig.6）。

Figure 6 不同接種密度下的HEK293T細胞活性和分布

隨后在搖瓶3D固定床模型細胞密度分別為2.0×10⁵,5.0×10⁵,1.0×10⁶, 2.0×10⁶ cells/cm²時進行轉(zhuǎn)染，考察轉(zhuǎn)染密度對慢病毒生產(chǎn)的影響。轉(zhuǎn)染時細胞密度為 2.0×10⁵和5.0×10⁵cells/cm²時，單細胞產(chǎn)毒量相近，約為0.5 TU/cell。當細胞密度升至 1.0×10⁶cells/cm²時，單細胞產(chǎn)毒量提高至0.8 TU/cell；與其他各組相比，單位體積、單位載體面積、單位細胞的病毒產(chǎn)量均最高。當細胞密度進一步提升時，單細胞產(chǎn)毒量反而下降（Fig.7）。

Figure 7 轉(zhuǎn)染時的細胞密度對慢病毒滴度的影響：(a) TU/mL；(b) TU/cm² ；(c) TU/cell (與“10”對比; ***: p<0.001)

最后在AD60 FBR中應用優(yōu)化后的轉(zhuǎn)染條件和細胞培養(yǎng)參數(shù)進行慢病毒制備，在反應器中以5.0×10⁴ cells/cm²的密度接種細胞，培養(yǎng)期間每天取樣，檢測細胞生長；當細胞密度達到1.0×10⁶ cells/cm²時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后更換含血清培養(yǎng)基。慢病毒生產(chǎn)期間每天檢測培養(yǎng)上清液中葡萄糖濃度。分析AD60 FBR中HEK293T細胞的生長數(shù)據(jù)（Fig.8），培養(yǎng)第1天時細胞密度為5.7×10⁴ cells/cm²，大于接種密度，表明細胞貼附后開始擴增。在第3天細胞生長進入指數(shù)生長期，第5天細胞密度增加至1.0×10⁶ cells/cm²。與搖瓶的培養(yǎng)結(jié)果相比，固定床反應器中細胞更快進入指數(shù)生長期。

Figure 8 固定床反應器中的細胞生長曲線

對AD60 FBR中生長階段的細胞活性和分布情況進行了檢測（Fig.9）。由圖可知，反應器載體填充材料PET膜材是由無序堆積的纖維形成的三維細胞培養(yǎng)載體；除部分纖維較稀疏的區(qū)域，細胞經(jīng)過5天生長后可較均勻地鋪滿材料，細胞活性良好，未見可觀察到的死細胞。表明該接種密度和轉(zhuǎn)染時的細胞密度較為合適，在充分利用PET床面積的同時未導致細胞過度重疊、聚團。

Figure 9 固定床反應器中的細胞分布

對AD60 FBR反應器中生產(chǎn)出的慢病毒進行了滴度檢測，在質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染后的第3天(即培養(yǎng)第8天)，慢病毒滴度顯著增加，此時上清液中的病毒滴度可達1.3×10⁷ TU/mL、8.5×10⁶ TU/cm²，單細胞產(chǎn)毒量為 8.5 TU/cell；與之相比，培養(yǎng)第 7 天時，上清液中病毒滴度為 2.5×10⁶ TU/mL、1.7×10⁶ TU/cm2，單細胞產(chǎn)毒量為1.7 TU/cell。培養(yǎng)第7天收獲1 L培養(yǎng)上清液，培養(yǎng)第8天收獲1.7 L培養(yǎng)上清液，合計收獲總病毒量為2.4×10¹⁰ TU，平均病毒滴度為8.9×10⁶ TU/mL、9.6×10⁶ TU/cm² (以2 m²等效面積計算為 1.2×10⁶TU/cm²)和9.6 TU/cell。上述數(shù)據(jù)證實AD60 FBR生產(chǎn)出的慢病毒滴度較高，表明所優(yōu)化的轉(zhuǎn)染條件和生產(chǎn)條件支持固定床反應器中慢病毒的高效生產(chǎn)。

Figure 10 固定床反應器中生產(chǎn)的慢病毒滴度：(a) TU/mL；(b) TU/cm² ；(c) TU/cell

以CEL-G^® Culture Ad60為代表的固定床生物反應器作為細胞大規(guī)模貼壁培養(yǎng)的設備，在慢病毒制備領(lǐng)域證實具有巨大的潛力。華東理工大學的研究通過優(yōu)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件和細胞培養(yǎng)參數(shù)，實現(xiàn)了固定床反應器中的高滴度慢病毒生產(chǎn)。相信未來通過工藝進一步優(yōu)化，AD60 FBR可以為LVs乃至更多病毒載體的大規(guī)模制備提供解決方案。并且，隨著研究的不斷深入，以固定床反應器為基礎(chǔ)開發(fā)可擴展、經(jīng)濟高效且臨床可接受的病毒生產(chǎn)工藝將會成為實現(xiàn)基因和細胞療法變革的基石。