在探索人體復雜的免疫系統時，我們經常與一類特殊細胞—中性粒細胞（Neutrophils）不期而遇。它們是血液中數量僅次于紅細胞的細胞類型，占據了成人白細胞總數的40-70%[1]。中性粒細胞的主要免疫功能包括吞噬、脫顆粒和形成中性粒細胞胞外陷阱(NETs)。此外，它們還分泌幾種調節炎癥的細胞因子和趨化因子[2]。然而，中性粒細胞在體外研究中卻充滿了挑戰，包括短至6-8小時的半衰期、對凋亡和激活的極度敏感性，以及難以擴增和冷凍保存的特性。用密度梯度等傳統方法分離特定的中性粒細胞群體是具有挑戰性的，因為這種方法會增加極化反應，導致中性粒細胞的人工激活[3,4]。
NanoCellect Biomedical, Inc. 推出的WOLF G2 單細胞柔性分選系統，以其溫和、低激活的分選方式，確保了更好的存活率和純度，使得中性粒細胞的研究和應用邁出了重要一步。
在室溫條件下采集全血并于兩小時內處理，通過雙梯度離心法從全血中分離中性粒細胞。全血與緩沖液（HBSS、1% BSA以及2mM EDTA）1:1混合后，置于由Leuko Spin Medium和PBMC Spin Medium組成的雙梯度中，經過1000 x g離心30分鐘，收集粒細胞層。再通過緩沖液洗滌和1X RBC Lysis Buffer裂解紅細胞，最后用分選緩沖液重懸細胞，使濃度達到1.0 x 10^7 cell/mL
用Human TruStain FcX和True-Stain Monocyte Blocker阻斷非特異性結合，并在室溫下撫育15分鐘，隨后用CD45 APC-Cy7、CD16 AF488、CD11b PE和SYTOX AADvanced對細胞進行染色。經37 μm濾帽過濾后，以3 x 105 cell/mL的濃度進行分析和分選。
感興趣的細胞群體由CD16-AF488陽性和SYTOX AADvanced陰性的活中性粒細胞組成(圖1)。將1 x 105個細胞分選到含有分選緩沖液的收集管中。此外，制備了一個樣本并用細胞活化混合物（BioLegend，#423301）進行刺激，作為中性粒細胞活化的對照。而且，使用單染對照、SpectraComp 補償微球（Slingshot Bio，#SSB-05-A）和 ViaComp 微球（Slingshot Bio，#SSBS-003）創建了一個補償矩陣。使用WOLF G2軟件進行細胞分選，通過一系列圈門策略，從單細胞門到存活細胞門，再到CD45陽性的白細胞門，最后確定CD16陽性的中性粒細胞。
圖1. 分選中性粒細胞的圈門策略：使用WOLF G2軟件，用戶可以輕松地對感興趣的群體進行圈門以排序，(A)使用FSC/BSC散點圖創建樣本門并消除碎片。(B)通過FSC-width vs FSC-H圖確定了單細胞門。(C)用活性染料從單細胞門鑒定活細胞，(D)白細胞鑒定為CD45+，(E)最后，中性粒細胞在CD45+ vs CD16+圖中被鑒定為CD16+。
分選后的樣本在37°C、5% CO2環境中孵育2小時，然后重新使用WOLF G2進行分析，評估存活率、純度和中性粒細胞的激活狀態。
1、WOLF G2分選后，純度從92 ± 1.9% SD提高至98 ± 0.3% SD（圖2），存活率從88 ± 1.6% SD提高至97 ± 0.1% SD（圖3）。雖然從梯度富集的樣品開始，但WOLF進一步去除了死亡的中性粒細胞，這些中性粒細胞可以繼續釋放細胞因子并增加樣品中活化的中性粒細胞的數量[5]。
圖2. 高純度中性粒細胞的分選結果: 基于活CD16-AF488陽性細胞進行分選后，中性粒細胞的純度提高了約6.0%。此外，用Wright染色的（B）全血和（C）分選后樣本的代表性圖像顯示了細胞碎片和不需要的細胞的有效去除。使用明場（ECHO Revolve）以40倍放大率對載玻片進行成像。
圖3. 分選后中性粒細胞活力: 在增加活中性粒細胞數量的同時，重要的是，與SYTOX AADvanced陽性死亡細胞超過11%的預分選樣品相比，分選后樣品中的死亡細胞數量減少了3倍以上，約為2.9%
2、分選的中性粒細胞與未分選對照相比，未觀察到激活中性粒細胞數量的變化，而激活對照組顯示CD11b陽性的激活中性粒細胞數量顯著增加（圖4）。
圖4. 分選后無中性粒細胞活化：使用微流控分選可分離出分選后無活化的中性粒細胞。相比之下，活化對照樣品與分選前和分選后的樣品相比，活化細胞增加了兩倍。
WOLF G2單細胞柔性分選系統為中性粒細胞的分離和研究提供了一種全新的方法，通過溫和的分選過程，實現了高純度和高存活率的目標，同時避免了細胞活化，為后續應用和新療法的發現提供了有力支持。
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2. Rosales, C. (2018). Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types? Frontiers in Physiology, 9. https://doi.org/10.3389/ fphys.2018.00113
3. Blanter, M., Gouwy, M., & Struyf, S. (2021). Studying Neutrophil Function in vitro: Cell Models and Environmental Factors. Journal of Inflammation Research, Volume 14, 141–162. https://doi.org/10.2147/jir.s284941
4. Blanter M, Cambier S, De Bondt M, Vanbrabant L, P?rtner N, Abouelasrar Salama S, Metzemaekers M, Marques PE, Struyf S, Proost P & Gouwy M (2022) Method Matters: Effect of Purification Technology on Neutrophil Phenotype and Function. Front. Immunol. 13:820058. doi: 10.3389/fimmu.2022.820058
5. Iba, T., Hashiguchi, N., Nagaoka, I., Tabe, Y., & Murai, M. (2013). Neutrophil cell death in response to infection and its relation to coagulation. Journal of Intensive Care, 1(1). https://doi.org/10.1186/20
